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應(yīng)用于His標(biāo)簽高效蛋白純化的理想注射泵解決方案

發(fā)布日期:2025-06-04      瀏覽次數(shù):201


蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的主要執(zhí)行者,其功能研究、結(jié)構(gòu)解析和藥物開發(fā)均依賴于高純度、高活性的目標(biāo)蛋白樣本。蛋白純化作為連接重組表達(dá)與功能研究的關(guān)鍵橋梁,在現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究中具有不可替代的地位。目前已有多種基于蛋白標(biāo)簽和層析技術(shù)的蛋白質(zhì)純化方法。蛋白標(biāo)簽(protein tags)是通過基因工程與重組蛋白融合的肽序列,可通過層析技術(shù)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的精準(zhǔn)分離與富集,用于后續(xù)的研究或復(fù)制。


His標(biāo)簽(多組氨酸標(biāo)簽)是在變性條件下純化重組蛋白的常用方案。His標(biāo)簽蛋白純化技術(shù)因其標(biāo)簽分子量小、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且對(duì)目標(biāo)蛋白功能、活性及構(gòu)象干擾極小等優(yōu)勢(shì)而被廣泛應(yīng)用。該技術(shù)通過基因工程手段在目標(biāo)蛋白N端融合6個(gè)連續(xù)組氨酸殘基(6×His),基于固定化金屬離子親和層析(IMAC)原理,使His標(biāo)簽與固定化鎳/鈷離子通過穩(wěn)定的配位鍵特異性結(jié)合。


固定化金屬離子親和層析(IMAC)是純化組氨酸標(biāo)簽蛋白的常規(guī)方法。該方法采用含有固定化金屬離子(如鈷離子,Co2?)的IMAC介質(zhì),通過金屬離子與His標(biāo)簽的配位結(jié)合實(shí)現(xiàn)目的蛋白的捕獲。將介質(zhì)裝填至層析柱后,以低咪唑濃度緩沖液作為上樣緩沖液攜帶目標(biāo)蛋白??刂凭彌_液以低流速緩慢流經(jīng)層析柱,使His標(biāo)簽蛋白與介質(zhì)中的Co2?充分結(jié)合。然后采用高咪唑濃度緩沖液通過競(jìng)爭(zhēng)性置換將目的蛋白洗脫回收。


這種方法通過在固定化金屬離子親和層析柱(IMAC column)中精確控制變性緩沖液(如含咪唑溶液)的體積與流速,可實(shí)現(xiàn)組氨酸標(biāo)簽蛋白的穩(wěn)定純化。純化過程的控制越精確,目標(biāo)蛋白在單次柱上操作中的回收率越高。采用可控且可重復(fù)的IMAC純化流程,研究人員可在最短時(shí)間內(nèi)獲得高純度、高活性的目標(biāo)蛋白。




應(yīng)用于His標(biāo)簽高效蛋白純化的理想注射泵解決方案

許多實(shí)驗(yàn)室致力于尋找一種經(jīng)濟(jì)高效的方法以實(shí)現(xiàn)高效的蛋白質(zhì)純化。一種便捷的方案是通過鈷重力柱以精確可控的方式輸送雙路獨(dú)立的咪唑緩沖液進(jìn)行可控洗脫,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)His標(biāo)簽蛋白的高效純化。針對(duì)該應(yīng)用的理想注射泵解決方案是通過I/O端口及內(nèi)置的編程功能,將兩臺(tái) Harvard Pump 11 Elite 可編程注射泵進(jìn)行聯(lián)用。此配置可構(gòu)建創(chuàng)新性的注射泵系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)對(duì)兩臺(tái)注射泵獨(dú)立流速的同步控制。利用內(nèi)置的多步驟編程及輸入/輸出信號(hào)通信功能,所有操作均可通過Pump 11 Elite的觸控界面完成,無需外部編程或計(jì)算機(jī)支持(見圖1)。

圖1


注射泵A:控制一支 10 mL 氣密型注射器,用于將含有His標(biāo)簽蛋白的低咪唑濃度緩沖液以 1 mL/min 的流速注入重力柱,總體積為10 mL,持續(xù)10分鐘。精確控制流速對(duì)于確保His標(biāo)簽蛋白與柱內(nèi)鈷基IMAC介質(zhì)充分結(jié)合至關(guān)重要。 


注射泵 B:控制一支 10 mL 氣密型注射器,用于輸送高咪唑濃度緩沖液,用以將結(jié)合在鈷基親和層析介質(zhì)上的標(biāo)簽蛋白洗脫下來。


下一步操作要求 注射泵 A 進(jìn)入回抽模式以完成灌注。注射泵 A 向注射泵 B 發(fā)送信號(hào),讓注射泵 B 通過其注射器吸入高咪唑濃度緩沖液。從注射模式切換至回抽模式所產(chǎn)生的壓力變化將觸發(fā)單向閥開啟,從而使兩臺(tái)泵均能充滿合適濃度的咪唑緩沖液?;爻檫^程需迅速但可控,以避免緩沖液發(fā)生脫氣現(xiàn)象。緩沖液一旦脫氣,將對(duì)重力柱中鈷基介質(zhì)上的蛋白純化反應(yīng)產(chǎn)生不利影響。


當(dāng)兩個(gè)注射器均完成裝填后,注射泵A 和 注射泵B 將同時(shí)按照預(yù)設(shè)的流量程序運(yùn)行:

注射泵A:輸送低咪唑濃度緩沖液,初始流速為 1mL/min,經(jīng)20分鐘后遞減至0 ml/min(見圖2)。

注射泵B:輸送高咪唑濃度緩沖液,初始流速為 0mL/min,經(jīng)20分鐘后遞增至1mL/min(見圖3)。

圖2 (左)  & 圖3 (右)


通過雙泵協(xié)同控制,鈷重力柱內(nèi)的總流速在梯度運(yùn)行期間始終維持在1mL/min,這樣的流速既能保證標(biāo)簽蛋白的有效洗脫,又可避免對(duì)重力柱超壓(見圖4)。

圖4




哈佛生物長(zhǎng)期專注于生命科學(xué)領(lǐng)域研究?jī)x器和科研設(shè)備的開發(fā)、制造和銷售,產(chǎn)品在全球范圍內(nèi)的制藥和生物技術(shù)公司、大學(xué)、政府實(shí)驗(yàn)室被廣泛使用。自1901年以來,哈佛一直致力于流體學(xué)生物研究,有著超過100年的注射泵設(shè)計(jì)制造經(jīng)驗(yàn)。自2011年以來,已有超過2000篇科技文獻(xiàn)使用了哈佛泵, 文獻(xiàn)范圍涵蓋了灌流、微流體、注射、靜電紡絲等。

作為美國哈佛注射泵的全國一級(jí)代理商,上海昊擴(kuò)將提供哈佛配套的注射泵、蠕動(dòng)泵和連續(xù)注射泵,滿足您的各種應(yīng)用需求。



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